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详细科学技术内容
本项目的总体思路：将南瓜果肉榨汁取上清，以阳离子交换层析一步法分离南瓜蛋白，避免通常采用的盐析法对蛋白活性的影响；培养出单晶，以X射线衍射法测定其高分辨的晶体结构；通过多种体外培养的肿瘤细胞系和人小鼠移植瘤模型测定南瓜蛋白的体内外抗肿瘤活性及对肿瘤细胞重要分子及其下游信号通路的影响以了解其作用机制；结合蛋白质测序结果及相关文献，通过分子生物学手段测定其编码基因序列，经原核系统表达重组南瓜蛋白并用于构建重组免疫毒素及测定其靶向杀伤作用。
本项目的研究成果为南瓜蛋白的结构及抗肿瘤作用研究的有关。从南瓜果肉中分离出高纯度的南瓜蛋白，获得了1.04？高分辨率的晶体结构；CUS晶体结构包含2个结构域—由7个α-螺旋和8个β-折叠构成的N端大结构域和3个α-螺旋和2个β-折叠组成的C端结构域；CUS由244个氨基酸残基组成，残基Tyr70、Tyr109、Glu158和Arg161构成CUS的RNA-N糖苷酶的活性中心；CUS含有一条混合型糖链GlcNAc2Man3Xyl，Asn225为糖基化位点；成熟CUS的编码基因大小为732bp。CUS对体外培养的多种肿瘤细胞（包括K562、NB4等白血病细胞系和HepG2、SW1990、PANC-1等实体瘤细胞系）具有明显的的增殖抑制和诱导凋亡作用，72小时的IC50多为1～5μg/ml，而对人正常肝细胞株和外周血淋巴细胞的抑制作用较小，表现出一定的选择性；南瓜蛋白对黑色素瘤B16细胞具有诱导分化作用；CUS与STI571、全反式维甲酸、亚砷酸、吉西他滨及吉非替尼等多种临床药物均具有协同抗肿瘤作用；CUS对吉西他滨耐药的胰腺癌细胞具有一定的逆转耐药性作用；CUS对多种人肿瘤小鼠移植瘤具有显著的抑制作用，其中对小鼠原位肝癌和胰腺癌的抑瘤率分别达77%和59%；CUS可下调K562细胞P210bcr/abl蛋白水平和c-Myc表达、下调HepG2细胞bcl2/bax的比率和激活caspase-3、下调胰腺癌细胞的EGFR、PDGFR、Notch等信号分子的蛋白表达水平及抑制其下游相关的信号通路；成熟CUS的编码基因经密码子优化后合成并克隆到表达载体，可通过原核系统表达出重组CUS及其含半胱氨酸的突变体，与纳米抗体7D12构建的重组免疫毒素rE/CUS，对EGFR高表达的肿瘤细胞具有选择性的杀伤作用，靶向治疗指数可达200以上。上述结果表明，南瓜蛋白是具有高效抗肿瘤作用的新的I型核糖体失活蛋白，可进行结构改造和用于制备免疫毒素，具有潜在的抗肿瘤临床应用前景。南瓜蛋白的抗肿瘤活性经多个课题组测试，得到了验证。
本项目共有18篇论文发表在国内学术刊物上：有关南瓜蛋白结构的有3篇，发表在J Struct Biol、Acta Crystallogr D Biol Crystallogr和Chinese J Struct Chem上，主要是首次报道南瓜蛋白的晶体结构及解析结果，奠定了南瓜蛋白结构研究的主要基础，被引用30篇次；有关南瓜蛋白抗肿瘤作用的有15篇，分别发表在Pancreas、oncology reports、Anticancer Agents Med Chem、Pharmacological Reports、Mol Med Report、Oncotarget、《中国药理学通报》、《中国药学杂志》、《中国实验血液学杂志》、《中国中西医结合杂志》、《中国普通外科杂志》和《福建医科大学学报》等杂志上，主要是关于天然南瓜蛋白的抗肿瘤作用及其机制研究以及原核表达重组南瓜蛋白及用于制备免疫毒素和靶向抗肿瘤作用的成果，组成南瓜蛋白抗肿瘤研究的基本框架，也为进一步南瓜蛋白的结构改造和抗肿瘤靶向治疗研究奠定基础，被引用112篇次。上述18篇论文总共被148篇次论文引用，其中他引达103篇次。本项目的主要论著目录及其被引用篇次如下：
1.Chen MH, Ye XM, Cai JH, Lin Yujuan. Crystallization and preliminary crystallographic study of cucurmosin ,a ribosome-inactivating protein from the sarcocarp of cucurbita moschata[J]. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr.2000,56(Pt 5):665-6.（被引用15篇次）
2.Shi XL, Zhou EX, Ye XM, Chen MH, Meehan ED, Chen LQ. Molecular replacement studies of cucurmosin from Cucurbita moschata:structure homology with trichosanthin[J].Chinese J Struct Chem, 2003, 22:165-168.
3.Xiaomin Hou, Edward J.Meehan, Jieming Xie, Mingdong Huang, Minghuang Chen*, Liqing Chen. Atomic resolution structure of cucurmosin, a novel type 1 ribosome- inactivating protein from the sarcocarp of Cucurbita moschata[J]. J Struct Biol, 2008,164(1):81-87.（被引用15篇次）
4.Zhang B, Huang H, Xie J*, Xu C, Chen M, Wang C, Yang A, Yin Q. Cucurmosin induces apoptosis of BxPC-3 human pancreatic cancer cells via inactivation of the EGFR signaling pathway[J]. Oncol Rep,2012,27(3):891-7.（被引用12篇次）
5.Xie J*,Que W,Liu H,Liu M,Yang A,Chen M.Anti-proliferative effects of cucurmosin on human hepatoma HepG2 cells[J]. Mol Med Report,2012,5(1):196-201.（被引用5篇次）
6.Jieming Xie*, Wenzhong Que, Minghuang Chen, Jiancheng Sun, Tinbo Liu, Huili Liu, Mei Liu, Aiqin Yang, Pei Yang and Yulu Wang.Antitumor effects of cucurmosin in human chronic myeloid leukemia occur through cell cycle arrest and decrease the Bcl-2/Bax ratio to induce apoptosis[J]. African Journal of Pharmacy and Pharmacology,2011, 5(7):985-992.（被引用5篇次）
7.Jieming Xie*, Congfei Wang, Aiqin Yang, Baoming Zhang, Qiang Yin, Heguang Huang and Minghuang Chen.Cucurmosin kills human pancreatic cancer SW-1990 cells in vitro and in vivo[J].Anticancer Agents Med Chem,2013,13(6):952-6.（被引用2篇次）
8.Jieming Xie*, Congfei Wang, Baoming Zhang, Aiqin Yang, Qiang Yin,Heguang Huang, Minghuang Chen. Cucurmosin induces the apoptosis of human pancreatic cancer CFPAC-1 cells by inactivating the PDGFR-β signalling pathway[J].Pharmacological Reports,2013,65(3):682-8.（被引用1篇次）
9.Congfei Wang, Aiqin Yang, Baoming Zhang,Qiang Yin, Heguang Huang,Minghuang Chen, Jieming Xie*. Pancreatic cancer PANC-1 cells growth inhibited by cucurmosin singly and combined with EGFR targeted drug[J].Pancreas,2014,43(2):291-7.（被引用6篇次）
10.Congfei Wang, Wei Zhang, Mingjuan Fu, Aiqin Yang, Heguang Huang*, Jieming Xie*. Establishment of human pancreatic cancer gemcitabineresistant cell line with ribbonu- cleotide reductase overexpression[J].Oncol Rep,2015,33(1):383-90.（被引用5篇次）
11.Cuimin Deng, Jiani Xiong, Xiaofan Gu, Xiaoying Chen,Zhe Wang,Duanduan Wang,Jingjing Tu,Jieming Xie. Novel recombinant immunotoxin of EGFR specific nanobody fused with cucurmosin, construction and antitumor efficiency in vitro[J]. Oncotarget,2017,8(24):38568-38580.（被引用2篇次）
12.谢捷明*,杨爱琴,张宝明,黄鹤光,陈明晃,王丛菲.南瓜蛋白对人胰腺癌细胞CFPAC-1增殖抑制及诱导凋亡作用[J].中国药学杂志,2012;47(12):956-959.（被引用3篇次）
13.许春森,黄鹤光,陈明晃,谢捷明*.南瓜蛋白对胰腺癌PANC-1细胞增殖和凋亡的影响.中国中西医结合杂志[J],2012,32(2):234-238.（被引用6篇次）
14.谢捷明*,刘梅,刘庭波,陈明晃,杨爱琴,杨沛.南瓜蛋白联合常用化疗药对NB4细胞增殖和凋亡的影响[J].中国实验血液学杂志,2012,20(6):1327-31.（被引用3篇次）
15.谢捷明*,杨爱琴,王丛菲,黄鹤光,等.南瓜蛋白联合吉非替尼对人胰腺癌BxPC-1细胞的抑制作用[J].中国药理学通报,2012.28(12):1724-8.（被引用6篇次）
16.许春森,黄鹤光,陈明晃,魏香兰,何莉,陈燕卿,谢捷明*.南瓜蛋白对人胰腺癌细胞系PANC-1的细胞毒性及化疗增敏作用[J].中国普通外科杂志,2009,18(3):1-4.（被引用6篇次）
17.谢捷明*,俞昌喜,陈明晃,许盈,赵蓉,吴国华,周琳瑛.南瓜蛋白对B16细胞的诱导分化作用[J].中国药理学通报,2006,22(3):329-332.（被引用34篇次）
18.孙建成,谢捷明*,张昆仲,黄自强,陈明晃.南瓜蛋白与STI571体外联合抗K562细胞的作用[J].福建医科大学学报,2008,42(1):30-32.（被引用16篇次）
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